手把手教学

 

 

        培养操作关键步骤

【培养基】：F-12K(CellCook cat:CM2004) + 10%胎牛血清(CellCook cat:CM1002L)，pH 7.2-7.4。实验室无菌操作条件不足时可添加1%青霉素-链霉素（双抗)。

【环境】：37℃、5% CO₂饱和湿度培养箱，避免频繁开关箱门温湿度波动，影响细胞状态！

【传代时机】：细胞汇合度达80%时传代（避免过密导致形态改变或传代密度太低导致细胞生长迟滞），常规实验推荐1:2-1:3（根据细胞状态调整），每2-3天传代一次。

✅ Step 1：弃旧培养基，PBS（无钙镁）轻柔洗涤2次（去血清残留，避免影响胰酶活性）。

✅ Step 2：0.25%胰酶-EDTA覆盖细胞层，37℃消化2-3分钟（镜下见细胞变圆、间隙增大立即终止）。
✅ Step 3：加含血清培养基中和胰酶终止消化，轻柔吹打成单细胞悬液。（吹打时使用 10mL 移液管，轻柔吹打 5-8 次，避免产生气泡）
✅ Step 4：离心（1000rpm, 5min） ，弃上清，重悬接种至新培养瓶，补加新鲜培养基。

【冻存】：对数期细胞+冻存液（F-12K（含 10 % FBS）+10 % DMSO），重悬（浓度1×10⁶-5×10⁶ cells/mL），梯度降温（4℃ 30分钟→-20℃ 1小时→-80℃过夜→液氮长期保存）。冻存管需标记细胞名称、代次、冻存日期。

若使用无血清冻存液可省去程序降温步骤，直接转入-80℃保存，但仍建议在-80℃放置24小时后再转移至液氮。

无血清冻存液使用方法与使用效果参考下文链接→

《无血清冻存液PK常规冻存液》

【复苏】：液氮中取出冻存管，37℃水浴1分钟内解冻，无菌操作转移至含预热培养基的离心管，离心去DMSO，重悬后接种，24小时后更换培养基（去除死亡细胞）。复苏后24小时内避免移动培养瓶，以促进贴壁

避坑指南

 

 

        常见问题解决方案

关键注意事项

避免频繁操作

反复洗涤或吹打会导致细胞活性下降，操作前规划好步骤，保持2-3天传代/换液处理一次的频率。

污染防控

严格无菌操作，定期对培养箱、操作台消毒，培养基出现浑浊或异常沉淀时及时确认丢弃。注意 A549/HeLa、A549/HEK293 交叉污染案例，每半年或 10 代内进行一次 STR 鉴定。

代次管理

A549细胞传代超过30代后可能出现基因漂移，实验尽量使用低代次细胞（<20代），并记录传代次数。

实验对照

设置空白对照组（仅培养基）和阴性对照组（正常肺上皮细胞，如BEAS-2B），排除非特异性干扰。

文献速递

 

 

       A549最新研究热点 

肿瘤机制研究

聚焦KRAS通路下游信号（如RAF/MEK/ERK、PI3K/Akt/mTOR）的激活机制，探索耐药相关分子（如BIM、MDR1）的调控网络。

药物筛选

用于肺癌化疗药物（顺铂、紫杉醇）、靶向药物（KRAS G12C抑制剂、MEK抑制剂）的体外药效评估，结合药敏实验优化用药方案。

基因编辑模型

通过CRISPR/Cas9技术构建特定基因敲除/敲入细胞系，研究抑癌基因（如p53、PTEN）的功能或验证候选致癌基因。

肿瘤微循环模拟

与巨噬细胞、成纤维细胞共培养，探究肿瘤-基质细胞相互作用对侵袭转移的影响，或构建3D类器官模型模拟体内肿瘤形态。

【CELLCOOK赛库生物A549细胞系相关应用文献】

①Huang X, Zhang J, Cun Y, et al. Spatial control of m6A deposition on enhancer and promoter RNAs through co-acetylation of METTL3 and H3K27 on chromatin[J]. Molecular Cell, 2025, 85(7): 1349-1365. e10.（IF：16.6）

②Zhuang W, Liu C, Hong Y, et al. Tumor-suppressive miR-4732-3p is sorted into fucosylated exosome by hnRNPK to avoid the inhibition of lung cancer progression[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2024, 43(1): 123.（IF：12.8）

③Luo H, Liu L, Liu X, et al. Interleukin-33 (IL-33) promotes DNA damage-resistance in lung cancer[J]. Cell Death & Disease, 2025, 16(1): 274.（IF：9.6）

④Wang C, Wang C, Xiao C, Zhang W, Guo Y, Qu M, Song Q, Qi X, Zou B. Tumor-Selective Gene Therapy: Using Hairpin DNA Oligonucleotides to Trigger Cleavage of Target RNA by Endogenous flap endonuclease 1 (FEN 1) Highly Expressed in Tumor Cells. Small. 2025 May;21(20):e2410146. doi: 10.1002/smll.202410146. Epub 2025 Mar 28. PMID: 40156152.（IF：12.1）

⑤Cai D, Chen X, Xu H, et al. m5C-modified circRREB1 promotes lung cancer progression by inducing mitophagy[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2025, 44(1): 203.（IF：12.8）

⑥Xu H, Zhao Q, Cai D, et al. o8G-modified circKIAA1797 promotes lung cancer development by inhibiting cuproptosis[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2025, 44(1): 110.（IF：12.8）

⑦Yang Y, Yang Y, Huang H, et al. PLCG2 can exist in eccDNA and contribute to the metastasis of non-small cell lung cancer by regulating mitochondrial respiration[J]. Cell death & disease, 2023, 14(4): 257.（IF：9.6）

⑧Liu S, Zhang L, Ding K, et al. S. glabra exerts anti-lung cancer effects by inducing ferroptosis and anticancer immunity[J]. Phytomedicine, 2024, 134: 155981.（IF：8.3）

⑨Yang C, Li H X, Gan H, et al. KRAS4B oncogenic mutants promote non-small cell lung cancer progression via the interaction of deubiquitinase USP25 with RNF31[J]. Developmental cell, 2025.（IF：8.7）

⑩Wang J, Liu P, Zhang R, et al. VASH2 enhances KIF3C-mediated EGFR-endosomal recycling to promote aggression and chemoresistance of lung squamous cell carcinoma by increasing tubulin detyrosination[J]. Cell Death & Disease, 2024, 15(10): 772.（IF：9.6）

⑪Guo W, Ren Z, Huang X, et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms[J]. Molecular Cell, 2025, 85(6): 1233-1246. e7.（IF：16.6）

⑫Lv J, Chen J, Song Y, et al. Co-Delivery of VEGF siRNA and THPP via Metal–Organic Framework Reverses Cisplatin-Resistant Non-Small Cell Lung Cancer and Inhibits Metastasis through a MUC4 Regulating Mechanism[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024, 16(42): 56910-56925.（IF：8.2）

本文所述方法仅供参考，具体操作需结合实验室条件优化。

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